Science

English

Equine influenza is a highly contagious respiratory disease in horses caused by influenza A viruses. In this work a real-time RT-PCR for fast and sensitive diagnosis of equine influenza viruses (EIV) targeting a highly conserved region of the matrix gene was developed. In addition two RT-PCR methods for the amplification of large parts of the matrix- and HA gene were adapted for molecular-epidemiological characterization of viruses. The primers of the real-time RT-PCR had homologies of 99.4% to EIV- and 97.7% to all influenza A viral sequences, whereas the minor groove binder (MGB) probe showed homologies of 99.3% and 99.6%, respectively. These high values allow application of the assay for influenza viruses in other species. Using 20 equine, 11 porcine and 2 avian samples, diagnostic suitability of the assay was confirmed. High specificity for influenza viruses was shown both experimentally and by software simulation. The assay analytical sensitivity was at 102–103 copies of RNA and 100–101 copies of DNA, respectively. This allows virus detection also in circumstances of minor viral shedding. All amplified EIV sequences were classified phylogenetically within the known lineages.

Keywords: equine influenza virus, real-time RT-PCR, MGB probe, molecular epidemiology, diagnosis

Deutsch

Equine Influenza ist eine durch Influenza A-Viren verursachte, kontagiöse Respirationserkrankung beim Pferd. In dieser Arbeit wurde eine real-time RT-PCR in einem konservierten Abschnitt des Matrix-Segments des viralen Genoms für die schnelle und sensitive Diagnose von equinen Influenzaviren (EIV) und je eine RT-PCR Methode im Matrix- und im HA-Segment für die molekular-epidemiologische Charakterisierung der Viren entwickelt. Die Primer der real-time RT-PCR sind zu 99.4% der bekannten EIV-Sequenzen und zu 97.7% aller Influenza A-Sequenzen homolog. Die Homologie der Minor Groove Binder (MGB)-Sonde lag bei 99.3% und 99.6%. Diese hohen Werte ermöglichen die Anwendung des Assays für Influenzaviren bei anderen Spezies. Die diagnostische Eignung der Methode wurde mit Hilfe von 20 equinen, 11 porcinen sowie 2 aviären Proben verifiziert. Eine hohe Spezifität für Influenzaviren wurde experimentell und mittels Software-Simulation gezeigt. Die analytische Sensitivität des Tests lag bei 102–103 RNA-Kopien und 100–101 DNA-Kopien, was den Virusnachweis auch bei geringer Virusausscheidung ermöglicht. Alle amplifizierten EIV-Sequenzen konnten phylogenetisch den bekannten Linien zugeordnet werden.

Schlüsselwörter: equines Influenzavirus, real-time RT-PCR, MGB-Sonde, molekulare Epidemiologie, Diagnostik

Français

L’Influenza équine est une maladie respiratoire contagieuse des chevaux, causée par des virus Influenza de type A. Dans la présente recherche, on a développé une PCR en temps réel dans un segment conservé de la matrice du génome viral du virus de l’influenza équine (EIV) pour obtenir un diagnostic rapide et sensible, ainsi que des méthodes de RT-PCR dans le segment de la matrice et dans le segment HA pour permettre une caractérisation moléculaire et épidémiologique des virus. Les primers des RT-PCR ont identiques à 99.4% avec les séquences connues des EIV et homologues à 97.7% avec toutes les séquences d’Influenza A. L’homologie de la sonde Minor Groove Binder (MGB) était de 99.3% et 99.6%. Ces valeurs élevées permettent l’emploi du test pour les virus Influenza chez d’autres espèces. L’aptitude diagnostique de la méthode a été vérifiée au moyen de 20 échantillons équins, 11 porcins ainsi que de 2 aviaires. On a pu démontrer une haute spécificité pour les virus Influenza par l’expérience ainsi qu’au moyen d’une simulation informatique. La sensivité analytique du test se situait à 102–103 copies RNA et 100–101 copies DNA, ce qui permet la mise en évidence du virus également lors d’excrétion très faible. Toutes les séquences d’EIV amplifiées ont pu être attribuées à des lignées connues phylogénétiquement.

Italiano

L’influenza equina è causata dal virus dell’influenza A, una malattia respiratoria contagiosa nei cavalli. In questo studio, una real-time RT-PCR è stata sviluppata in una porzione conservata del segmento matrice del genoma virale per la diagnosi rapida e sensibile del virus dell’influenza equina e un metodo RT-PCR ciascuno nella matrice e nel segmento HA per la caratterizzazione epidemiologia molecolare dei virus. I primer della real-time RT-PCR sono omologhe al 99.4% delle sequenze del virus dell’influenza equina conosciute e al 97,7% di tutte le sequenze di influenza A omologhe. L’omologia della sonda Minor Groove Binder (MGB) si situava tra il 99.3% e il 99.6%. Questi elevati livelli consentono l’utilizzo del test per i virus influenzali di altre specie. L’idoneità diagnostica del metodo è stata verificata con l’aiuto di 20 campioni equini, 11 porcini e 2 aviari. Un’alta specificità per il virus influenzale è stata dimostrata sperimentalmente e via delle simulazioni software. La sensitività analitica dei test si situa tra 102–103 copie di RNA e tra 100–101 copie di DNA cosa che rende possibile il rilevamento del virus anche quando lo spargimento virale è basso. Tutte le sequenze del virus dell’influenza equina amplificate sono state associate filogeneticamente con le linee conosciute.