Science

English

Molecular based approaches have gained increasing importance in routine mastitis diagnostics for typing and antibiotic resistance testing of Staphylococcus aureus. Out of 78 S. aureus strains isolated from bovine mastitis milk 10 of them harbored blaZ, blaI and blaR genes. Although 5 strains were phenotypically resistant to penicillin, the other 5 (all belonging the clonal complex 8) were penicillin susceptible. PCR amplification confirmed the presence of the blaZ, blaR and blaI genes in all 5 strains. Sequencing of these genes uncovered a 29 base deletion within the blaZ gene in all these strains that causes a translational frame shift, which is predicted to induce abrogation of BlaZ expression. Additionally single nucleotide insertions and deletions were detected in blaR of 3 strains. These insertions cause translation reading frame shifts and premature stop codons that are predicted to induce expression of truncated BlaR proteins. Using the genetically altered blaZ genes detected as targets, a real-time PCR system for detecting CC8 associated blaZ positive S. aureus strains that still remain susceptible to penicillin was developed. Such strains are part of detection challenges that must be considered in routine application of genotypic resistance testing of bovine mastitis S. aureus.

Keywords: bovine mastitis,Staphylococcus aureus,beta-lactamase,penicillin resistance

Deutsch

Molekulare Methoden zur Typisierung von S. aureus und zur Testung solcher Stämme auf das Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen gewinnen in der Mastitisdiagnostik zunehmend an Bedeutung. Von 78 untersuchten S. aureus Stämmen, isoliert aus bovinen Mastitiden, wiesen 10 davon die Gene blaZ, blaI and blaR auf. Nur 5 dieser Stämme waren allerdings phänotypisch Penicillin resistent, die anderen 5 Stämme (alle gehörten zum klonalen Komplex 8) waren Penicillin empfindlich. Mittels PCR konnte in letzteren 5 Stämmen das Vorhandensein der Gene blaI and blaR bestätigt werden. Die Sequenzierung des blaZ Gens zeigte in allen Stämmen eine 29 bp grosse Deletion, mit der Folge, dass das BlaZ Protein nicht exprimiert wird. Zudem wurde in den blaR Genen von 3 Stämmen Insertionen und Deletionen von einzelnen Nucleotiden gefunden. Diese führen zu verfrühten Stopcodons und damit zur Expression von veränderten BlaR Proteinen. Gestützt auf den genetisch veränderten blaZ Genen wurden eine real-time PCR zum Nachweis von balZ tragenden S. aureus Stämmen des klonalen Komplexes 8, die phänotypisch Penicillin empfindlich sind, etabliert. Solche Stämme stellten bei der routinemässigen Anwendung von PCR Methoden in der Mastitisdiagnostik bis anhin eine diagnostische Herausforderung dar.

Schlüsselwörter: bovine Mastitis,Staphylococcus aureus,Beta-Lactamasen,Penicillinresistenz

Français

Les techniques moléculaires pour typiser les S. aureus et pour tester ces souches quant à la présence des gènes de résistance aux antibiotiques gagnent régulièrement en importance dans le diagnostic des mammites. Sur 78 souches de S. aureus, isolées de mammites bovines, 10 présentaient les gènes blaZ, blaI et blaR. Toutefois seules 5 de ces souches présentaient une résistance à la pénicilline, les 5 autres (appartenant toutes au complexe clonal 8) étaient sensibles à la pénicilline. On a pu confirmer par PCR la présence des gènes blaI et blaR dans ces 5 dernières souches. Le séquençage du gène blaZ a montré dans toutes ces souches une délétion importante de 29 bp avec pour conséquence que la protéine BlaZ n'était pas exprimée. En outre on a trouvé sur les gènes blaR de 3 souches des insertions et des délétions de nucléotides isolés. Cela conduit à des stop codons prématurés et donc à l'expression de protéines BlaR modifiées. En se basant sur les gènes blaZ modifiés, on a établi une PCR en temps réel pour identifier les souches de S. aureus du complexe clonal 8 sensibles à la pénicilline. De telles souches représentaient jusqu'à maintenant un défi dans l'utilisation de routine de la PCR dans le diagnostic des mammites.

Italiano

Metodi molecolari per la tipizzazione di S. aureus e per verificare la presenza di tali ceppi in geni resistenti agli antibiotici stanno diventando sempre più importanti nella diagnostica della mastite. Sono stati controllati 78 ceppi di S. aureus, isolati da mastite bovina, di cui 10 presentavano i geni blaZ, blaI e blaR. Solo 5 ceppi erano sotto il profilo fenotipico resistenti alla penicillina, gli altri 5 (tutti appartenenti al complesso clonale 8) erano sensibili a quest'ultima. Negli ultimi 5 ceppi è stata confermata, via PCR, la presenza dei geni blaI e blaR. Il sequenziamento del gene blaZ ha rivelato in tutti i ceppi una grande delezione 29 bp con conseguenza che la proteina BlaZ non veniva espressa. Inoltre nel gene blaR di 3 ceppi, si sono riscontrati inserimenti e delezioni di singoli nucleotidi. Questi hanno condotto a dei codoni di stop prematuri e quindi all'espressione delle proteine BlaR alterata. Sulla base dei geni blaZ, geneticamente modificati, è stato definito un PCR in tempo reale per dimostrare che i ceppi di S. aureus, portatori di blaZ nel complesso clonale 8, sono sensibili a livello fenotipico alla penicillina. Questi ceppi confermano che un'applicazione di routine dei metodi PCR nella diagnosi della mastite è stata finora una sfida diagnostica.