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Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Qualität und Kryokonservierung von Hengstsamen

S. Weiss1, F. Janett2, D. Burger1, M. Hässig2, R. Thun2
1Nationalgestüt, Avenches, 2Klinik für Fortpflanzungsmedizin, Universität Zürich

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Abstracts: English - Deutsch - Français - Italiano

English


The aim of the present study was to investigate the influence of various centrifugation methods on sperm loss and quality of frozen-thawed semen. From at a total of 8 Warmblood stallions of the National Stud Farm in Avenches, 3 ejaculates each were collected and seminal plasma was removed using 3 different centrifugation regimes. In method I (reference method) centrifugation occurred by a speed of 600 x g during 10 minutes. In method II 1000 x g was used during 2 minutes while in method III centrifugation was performed by 2000 x g during 2 minutes. After centrifugation 90% of the supernatant was removed and sperm loss calculated. After resuspension of the pellet with freezing medium, functional membrane integrity was evaluated by HOS-test and motility determined. In frozen-thawed semen motility, viability as well as functional membrane integrity (HOS-test) and acrosome status using chlortetracyclinassay (CTA) were assessed. Our results demonstrate that mean sperm loss (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) was significantly (P less than 0.05) different between the three centrifugation regimes. Regarding semen quality of frozen-thawed semen, HOS in method III (52.1%) was significantly lower than in methods I (55.5%) and II (55.3%). Evaluation of the acrosome status by CTA showed that more than 70% of sperm cells were capacitated and 25% capacitated and acrosome reacted. From our results we conclude that sperm loss and functional membrane integrity (HOS-test) in frozen-thawed semen were significantly influenced by the centrifugation regime. Therefore, stallion semen should be centrifuged at 600 x g during 10 minutes before freezing in order to obtain low sperm loss and a good quality of frozen-thawed semen.

Keywords: stallion,cryopreservation,semen quality,centrifugation

Deutsch

Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Qualität und Kryokonservierung von Hengstsamen

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von verschiedenen Zentrifugationsmethoden auf Spermienverlust und Gefriersamenqualität abzuklären. Dazu wurden je drei Ejakulate von 8 gekörten Warmbluthengsten des Nationalgestüts Avenches gewonnen, und zur Entfernung des Seminalplasmas nach drei verschiedenen Methoden zentrifugiert. Bei Methode I (Referenzmethode) erfolgte die Zentrifugation bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten. Bei Methode II wurde bei 1000 x g während 2 Minuten und bei Methode III bei 2000 x g während 2 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 90% des Überstandes abpipettiert und darin die Anzahl Samenzellen (Spermienverlust) bestimmt. Nach Resuspension mit Gefrierverdünner erfolgte die Bestimmung der funktionellen Membranintegrität mittels HOS-Test sowie die Beurteilung der Motilität. Im aufgetauten Samen prüften wir die Motilität, die Vitalität (SYBR-14/PI), die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) und den Akrosomstatus mit dem Chlortetracyclinassay (CTA). Unsere Ergebnisse zeigen, dass der durchschnittliche Spermienverlust (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) bei allen drei Zentrifugationsmethoden signifikant (P weniger als 0.05) verschieden war. Bei den Samenqualitätsparametern im aufgetauten Samen konnten wir nur im HOS-Test bei Methode III (52.1%) signifikant schlechtere Werte als bei den Methoden I (55.5%) und II (55.3%) feststellen. Der zur Bestimmung des Akrosomstatus durchgeführte CTA zeigte, dass bei allen drei Methoden im aufgetauten Samen mehr als 70% der Spermien kapazitiert und rund 25% kapazitiert und akrosomreagiert waren. Aufgrund unserer Ergebnisse kann gefolgert werden, dass sowohl der Spermienverlust wie auch die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode signifikant beeinflusst wird. Deshalb soll der Hengstsamen vor der Kryokonservierung bei 600 x g während 10 Minuten zentrifugiert werden, da mit dieser Methode der Spermienverlust am geringsten und die Samenqualität nach dem Auftauen am besten waren.

Schlüsselwörter: Hengst,Kryokonservierung,Samenqualität,Zentrifugation

Français


Le but de cette étude était d´éclaircir l´influence de diverses méthodes de centrifugation sur la perte en spermatozoïdes et la qualité de la semence congelée. Pour ce faire, on a recueilli 3 éjaculats provenant de 8 étalons approuvés du Haras national d´Avenches et on les a centrifugés pour séparer le plasma séminal selon 3 méthodes différentes. Dans la méthode I (méthode de référence), la centrifugation a eu lieu avec une accélération de 600 x g pendant 10 minutes. Dans la méthode II, on a appliqué 1000 x g pendant 2 minutes et dans la méthode III, 2000 x g pendant 2 minutes. Après centrifugation, 90% du surnageant a été chaque fois pipeté et on a déterminé son contenu en spermatozoïdes. Après resuspension avec le diluant de congélation, on a observé l´intégrité fonctionnelle de la membrane au moyen du test HOS et on a jugé de la motilité. Dans les semences décongelées, on a examiné la motilité, la vitalité (SYBR-14/PI), l´integrité fonctionnelle de la membrane (test HOS) et le statut de l´acrosome avec le test à la chlorotétracycline (CTA). Nos résultats montrent que la perte en spermatozoïdes (I: 1,9%; II: 8,7%; III: 3,7%) est significativement différente (P moins de 0,05) selon la méthode de centrifugation. Pour ce qui est des paramètres de qualité de la semence décongelée, il n´a été possible de constater des valeurs significativement moins bonnes qu´avec la méthode III (52,1%) par rapport aux méthodes I (55,5%) et II (55,3%). Le CTA utilisé pour définir le statut de l´acrosome a montré que, pour les 3 méthodes, plus de 70% des spermatozoïdes étaient capacités et que 25% étaient capacités et acrosomés. Sur la base de nos observations, on peut conclure qu´aussi bien la perte de spermatozoïdes que l´intégrité fonctionnelle de la membrane (test HOS) sont influencés de façon significative par la méthode de centrifugation. Il convient donc de centrifuger la semence d´étalon avant cryoconservation à 600 x g pendant 10 minutes car c´est cette méthode qui engendre la plus petite perte en spermatozoïdes et conserve la meilleure qualité de semence après décongélation.

Italiano


Scopo de presente studio è di chiarire l´influsso dei differenti metodi di centrifugazione sulla perdita di spermatozoi e sulla qualità dei semi congelati. Da 8 stalloni mezzosangue selezionati della stazione di inseminazione di Avenches sono stati presi su ognuno 3 eiaculati, e centrifugati con 3 differenti metodi per estrarre il plasma seminale. La centrifugazione con il metodo I (metodo di referenza) è avvenuta con una accelerazione centrifuga relativa di 600 x g durante 10 min, con il metodo II di 1000 x g durante 2 minuti e con il metodo III di 2000 x g durante 2 minuti. Dopo la centrifugazione il 90% del supernatante è stato pipettato ed è stato determinato il numero delle cellule seminali (perdita di spermatozoi). Dopo la risospensione con un diluente per la congelazione sono state definite l´integrità funzionale della membrana tramite test HOS e la valutazione della motilità. Nei semi disgelati sono stati esaminati la motilità, la vitalità (SYBR-14/PI), l´integrità funzionale della membrana (test HOS) e lo stato degli acrosomi con assay della clorotetraciclina (CTA). I nostri risultati rilevano che in media la perdita di spermatozoi (I, 1,9%; II, 8,7%; III, 3,7%) in tutti e tre i metodi di centrifugazione era significativamente differente (P meno di 0.05). Per quel che concerne i parametri di qualità dello sperma tramite test HOS abbiamo riscontrato dei risultati peggiori nello sperma disgelato soltanto nel metodo III (52,1%) e non nei metodi I (55,5% e II (55,3%). La determinazione dello stato degli acrosomi effettuato con CTA ha mostrato che per tutti e tre i metodi con semi disgelati più del 70% degli spermatozoi avevano effettuato la capacitazione e all´incirca il 25% oltre alla capacitazione erano in reazione con gli acrosomi. Sulla base dei risultati ottenuti si può dedurre che sia la perdita di spermatozoi sia l´integrità funzionale della membrana (test HOS) in semi disgelati sono significatamente influenzati dai metodi di centrifugazione. Perciò i semi di stalloni devono essere centrifugati prima della conservazione criogena con 600 x g durante 10 minuti. Grazie a questo metodo la perdita di spermatozoi è minima e la qualità del seme migliore dopo lo sgelamento.