Science

English

The aim of the present study was to investigate the influence of various centrifugation methods on sperm loss and quality of frozen-thawed semen. From at a total of 8 Warmblood stallions of the National Stud Farm in Avenches, 3 ejaculates each were collected and seminal plasma was removed using 3 different centrifugation regimes. In method I (reference method) centrifugation occurred by a speed of 600 x g during 10 minutes. In method II 1000 x g was used during 2 minutes while in method III centrifugation was performed by 2000 x g during 2 minutes. After centrifugation 90% of the supernatant was removed and sperm loss calculated. After resuspension of the pellet with freezing medium, functional membrane integrity was evaluated by HOS-test and motility determined. In frozen-thawed semen motility, viability as well as functional membrane integrity (HOS-test) and acrosome status using chlortetracyclinassay (CTA) were assessed. Our results demonstrate that mean sperm loss (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) was significantly (P less than 0.05) different between the three centrifugation regimes. Regarding semen quality of frozen-thawed semen, HOS in method III (52.1%) was significantly lower than in methods I (55.5%) and II (55.3%). Evaluation of the acrosome status by CTA showed that more than 70% of sperm cells were capacitated and 25% capacitated and acrosome reacted. From our results we conclude that sperm loss and functional membrane integrity (HOS-test) in frozen-thawed semen were significantly influenced by the centrifugation regime. Therefore, stallion semen should be centrifuged at 600 x g during 10 minutes before freezing in order to obtain low sperm loss and a good quality of frozen-thawed semen.

Keywords: stallion,cryopreservation,semen quality,centrifugation

Deutsch

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von verschiedenen Zentrifugationsmethoden auf Spermienverlust und Gefriersamenqualität abzuklären. Dazu wurden je drei Ejakulate von 8 gekörten Warmbluthengsten des Nationalgestüts Avenches gewonnen, und zur Entfernung des Seminalplasmas nach drei verschiedenen Methoden zentrifugiert. Bei Methode I (Referenzmethode) erfolgte die Zentrifugation bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten. Bei Methode II wurde bei 1000 x g während 2 Minuten und bei Methode III bei 2000 x g während 2 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 90% des Überstandes abpipettiert und darin die Anzahl Samenzellen (Spermienverlust) bestimmt. Nach Resuspension mit Gefrierverdünner erfolgte die Bestimmung der funktionellen Membranintegrität mittels HOS-Test sowie die Beurteilung der Motilität. Im aufgetauten Samen prüften wir die Motilität, die Vitalität (SYBR-14/PI), die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) und den Akrosomstatus mit dem Chlortetracyclinassay (CTA). Unsere Ergebnisse zeigen, dass der durchschnittliche Spermienverlust (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) bei allen drei Zentrifugationsmethoden signifikant (P weniger als 0.05) verschieden war. Bei den Samenqualitätsparametern im aufgetauten Samen konnten wir nur im HOS-Test bei Methode III (52.1%) signifikant schlechtere Werte als bei den Methoden I (55.5%) und II (55.3%) feststellen. Der zur Bestimmung des Akrosomstatus durchgeführte CTA zeigte, dass bei allen drei Methoden im aufgetauten Samen mehr als 70% der Spermien kapazitiert und rund 25% kapazitiert und akrosomreagiert waren. Aufgrund unserer Ergebnisse kann gefolgert werden, dass sowohl der Spermienverlust wie auch die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode signifikant beeinflusst wird. Deshalb soll der Hengstsamen vor der Kryokonservierung bei 600 x g während 10 Minuten zentrifugiert werden, da mit dieser Methode der Spermienverlust am geringsten und die Samenqualität nach dem Auftauen am besten waren.

Schlüsselwörter: Hengst,Kryokonservierung,Samenqualität,Zentrifugation

Français

Le but de cette étude était d´éclaircir l´influence de diverses méthodes de centrifugation sur la perte en spermatozoïdes et la qualité de la semence congelée. Pour ce faire, on a recueilli 3 éjaculats provenant de 8 étalons approuvés du Haras national d´Avenches et on les a centrifugés pour séparer le plasma séminal selon 3 méthodes différentes. Dans la méthode I (méthode de référence), la centrifugation a eu lieu avec une accélération de 600 x g pendant 10 minutes. Dans la méthode II, on a appliqué 1000 x g pendant 2 minutes et dans la méthode III, 2000 x g pendant 2 minutes. Après centrifugation, 90% du surnageant a été chaque fois pipeté et on a déterminé son contenu en spermatozoïdes. Après resuspension avec le diluant de congélation, on a observé l´intégrité fonctionnelle de la membrane au moyen du test HOS et on a jugé de la motilité. Dans les semences décongelées, on a examiné la motilité, la vitalité (SYBR-14/PI), l´integrité fonctionnelle de la membrane (test HOS) et le statut de l´acrosome avec le test à la chlorotétracycline (CTA). Nos résultats montrent que la perte en spermatozoïdes (I: 1,9%; II: 8,7%; III: 3,7%) est significativement différente (P moins de 0,05) selon la méthode de centrifugation. Pour ce qui est des paramètres de qualité de la semence décongelée, il n´a été possible de constater des valeurs significativement moins bonnes qu´avec la méthode III (52,1%) par rapport aux méthodes I (55,5%) et II (55,3%). Le CTA utilisé pour définir le statut de l´acrosome a montré que, pour les 3 méthodes, plus de 70% des spermatozoïdes étaient capacités et que 25% étaient capacités et acrosomés. Sur la base de nos observations, on peut conclure qu´aussi bien la perte de spermatozoïdes que l´intégrité fonctionnelle de la membrane (test HOS) sont influencés de façon significative par la méthode de centrifugation. Il convient donc de centrifuger la semence d´étalon avant cryoconservation à 600 x g pendant 10 minutes car c´est cette méthode qui engendre la plus petite perte en spermatozoïdes et conserve la meilleure qualité de semence après décongélation.

Italiano

Scopo de presente studio è di chiarire l´influsso dei differenti metodi di centrifugazione sulla perdita di spermatozoi e sulla qualità dei semi congelati. Da 8 stalloni mezzosangue selezionati della stazione di inseminazione di Avenches sono stati presi su ognuno 3 eiaculati, e centrifugati con 3 differenti metodi per estrarre il plasma seminale. La centrifugazione con il metodo I (metodo di referenza) è avvenuta con una accelerazione centrifuga relativa di 600 x g durante 10 min, con il metodo II di 1000 x g durante 2 minuti e con il metodo III di 2000 x g durante 2 minuti. Dopo la centrifugazione il 90% del supernatante è stato pipettato ed è stato determinato il numero delle cellule seminali (perdita di spermatozoi). Dopo la risospensione con un diluente per la congelazione sono state definite l´integrità funzionale della membrana tramite test HOS e la valutazione della motilità. Nei semi disgelati sono stati esaminati la motilità, la vitalità (SYBR-14/PI), l´integrità funzionale della membrana (test HOS) e lo stato degli acrosomi con assay della clorotetraciclina (CTA). I nostri risultati rilevano che in media la perdita di spermatozoi (I, 1,9%; II, 8,7%; III, 3,7%) in tutti e tre i metodi di centrifugazione era significativamente differente (P meno di 0.05). Per quel che concerne i parametri di qualità dello sperma tramite test HOS abbiamo riscontrato dei risultati peggiori nello sperma disgelato soltanto nel metodo III (52,1%) e non nei metodi I (55,5% e II (55,3%). La determinazione dello stato degli acrosomi effettuato con CTA ha mostrato che per tutti e tre i metodi con semi disgelati più del 70% degli spermatozoi avevano effettuato la capacitazione e all´incirca il 25% oltre alla capacitazione erano in reazione con gli acrosomi. Sulla base dei risultati ottenuti si può dedurre che sia la perdita di spermatozoi sia l´integrità funzionale della membrana (test HOS) in semi disgelati sono significatamente influenzati dai metodi di centrifugazione. Perciò i semi di stalloni devono essere centrifugati prima della conservazione criogena con 600 x g durante 10 minuti. Grazie a questo metodo la perdita di spermatozoi è minima e la qualità del seme migliore dopo lo sgelamento.